ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para
la separación de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico. La separación
puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej.,
electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una
matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución
(electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación
obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN
recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y
separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del
experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis
de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida.
Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los
dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS (detergente)
que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular
de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico,
éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red
tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor,
más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán
cerca del lugar de partida.
La gran
mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y,
al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles
dependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos.
Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.
Por lo
general, para caracterizar la molécula se
determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y se
utiliza para determinar, en el caso de proteínas,
la masa molecular o para detectar cambios
de aminoácidos y separar cuantitativamente distintas
especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño,
medido en pares de bases
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una
corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según
su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez
por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en
los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la
electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en
un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino
se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas ,
se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias
de bajo peso molecular.
FUNDAMENTO
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas
y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan
una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando
transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas esta
gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el
solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone ,
por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o
movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia
denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta
con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca
que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las
moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a
moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente
podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga
mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un
gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que
atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de
los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas
será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS ZONALES
Son los más comunes, dada su alta
aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de
mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas
a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los
soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento
de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel
(celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre
otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una
cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la
longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El
equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u
horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más
utilizados son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman
por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador,
es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de
forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea
menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.
Electroforesis en geles de
gradientes. El uso de geles de poliacrilamida que
tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida,
y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener
ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel
en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce
una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las
ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango de
pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con
los de una concentración fija.
Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido
(originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición
homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad
de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de
fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el
paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de
alrededor 20.000 nucleótidos.
Electroforesis capilar. La electroforesis capilar se basa en los
mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza
condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de
ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de
silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO)
generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como
resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el
frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución.
La ventaja de esta técnica es que el
capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina
para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que
permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line.
Con esta técnica descripta es posible
separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas
en forma simultánea.
Isoelectroenfoque. Esta técnica, habitualmente denominada
electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un
gradiente de pH. Las moléculas
amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una
diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y
la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH
tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro
del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH
inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran
hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos
que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el
ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con
su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán.
De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde
coincide su punto isoeléctrico con el pH.
Electroforesis bidimensional. La electroforesis bidimensional se basa
en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una
en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una
primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso
molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es
una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores
experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del
gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del
reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
